DNA ricombinante

esci dascienze.htm

difese immunitarie, sieroterapia, vaccinazione

http://digilander.libero.it/furlanma/cercabio/difesa.html

descrizione tecniche usate per creare cloni batterici mediante la tecnica

del DNA ricombinante

esempio di DNA ricombinante cioè DNA formato da elementi o geni provenienti da individui anche appartenenti a specie diverse es.geni umani inseriti in DNA batterico

Si deve trovare il modo di inserire geni umani in DNA batterico

per ottenere una popolazione di batteri (CLONE) tutti dotati

del gene umano che si desidera rendere funzionale sfruttando

il metabolismo batterico:

es.far produrre ai batteri proteine,ormoni,anticorpi umani

problema:inserire gene umano in un batterio

per indurlo a moltiplicare il gene stesso

allo scopo di averne varie copie disponibili per lo studio

oppure per sintetizzare la molecola codificata:es.insulina

sfruttando la tecnica del DNA ricombinante

elementi necessari per la operazione:

1..DNA con gene della insulina

2..Batteri nei quali inserire il gene da moltiplicare

3..Vettore per trasferire Gene in Batterio:plasmide o fago

4..Enzima di restrizione per segmentare DNA e aprire Plasmide

5..Enzima DNA-ligasi per collegare DNA a plasmide

6..Antibiotici per selezionare batteri ricombinanti da altri

7..Tecniche per riconoscere gene integrato in ogni batterio

8..Colture per moltiplicare batteri ricombinanti con gene insulina

Nota su Plasmide batterico:

molecola breve di DNA chiusa ad anello,che si moltiplica

autonomamemte e si trasmette ai batteri generati

spesso codifica per resistenza a uno o più antibiotici

Nota su Enzimi di restrizione presenti nei batteri

ogni enzima di restrizione riconosce una specifica sequenza

di nucleotidi presenti in ogni tipo di DNA

e separa in due parti il DNA nel punto relativo alla sequenza

In questo modo può frammentare un segmento lungo di DNA

in segmenti più brevi,o aprire anello di plasmide

FASI necessarie per raggiungere il risultato

1..isolare cromosoma con gene da duplicare

2..segmentare DNA usando enzima di restrizione E1

3..isolare plasmidi da colonie batteriche :plasmidi che

..presentano resistenza per AMPICILLINA e TETRACICLINA

4..aprire anello plasmidiale con stesso enzima di restrizione E1

..viene aperto in corrispondenza del gene per TETRACICLINA

5..mescolare frammenti di DNA e plasmidi in presenza di Ligasi

6..inserire i plasmidi in coltura batterica

7..necessario selezionare dalla colonia batteri

..senza plasmidi,con plasmidi puri,plasmidi ricombinanti

8..si tratta la colonia con antibiotico AMPICILLINA

..batteri senza plasmidi:muoiono

..batteri con plasmidi rimangono vivi

9..necessario separare batteri con plasmidi ricombinanti

..da batteri con plasmidi puri

10.si separano singoli batteri e si coltivano separatamente

.in colture numerate,in doppia copia per ogni colonia

.copia1 per controllo e copia2 per riconoscimento

11.si tratta ogni colonia copia2 con TETRACICLINA

12.colonie con plasmidi puri sono resistenti alla TETRACICLINA

.colonie con plasmidi ricombinanti hanno perduto la resistenza

.perchè il GENE si è inserito interrompendo il sito tetraciclina

13.si possono cosi riconoscere le colonie portatrici di plasmidi

.ricombinanti e usare le corrispondenti colonie copia1

14.Problema:con varie tecniche si procede al riconoscimento

.del gene o dei geni integrati nei diversi plasmidi delle

.colonie batteriche ricombinanti

15.operando con il genoma completo di una specie

.si ottiene un insieme di colture batteriche portatrici

.di singoli geni o gruppi di geni:GENOTECA

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